MTT法作為一種經(jīng)典的細(xì)胞活力檢測技術(shù)，其原理基于活細(xì)胞線粒體中的琥珀酸脫氫酶將MTT檢測細(xì)胞增殖凋亡還原為藍(lán)紫色甲瓚結(jié)晶，通過酶標(biāo)儀測定吸光度(OD值)間接反映細(xì)胞數(shù)量或活性。然而，實驗中OD值異常是常見問題，可能由以下原因?qū)е拢?br />
1. 細(xì)胞接種密度不當(dāng)
問題：細(xì)胞濃度過高會導(dǎo)致培養(yǎng)基營養(yǎng)耗竭，細(xì)胞進(jìn)入G0期甚至死亡；濃度過低則OD值接近空白對照，誤差占比較大。
解決方案：預(yù)實驗需優(yōu)化接種密度，并通過標(biāo)準(zhǔn)曲線確定線性范圍。
2. MTT試劑配制與保存錯誤
問題：
MTT檢測細(xì)胞增殖凋亡粉末未充分溶解或濾菌不完，可能導(dǎo)致沉淀殘留干擾吸光度；反復(fù)凍融或保存不當(dāng)會使試劑失效，呈現(xiàn)灰綠色。
解決方案：現(xiàn)用現(xiàn)配較佳，若需保存，分裝為小劑量于20℃避光保存，避免反復(fù)凍融。使用時確保MTT溶液為黃色澄清狀，若變色則立即棄用。
3. 邊緣效應(yīng)與蒸發(fā)影響
問題：96孔板邊緣孔因水分蒸發(fā)快、氣體交換不均，易出現(xiàn)OD值偏高或偏低。
解決方案：邊緣32孔填充無菌PBS，中間孔用于實驗；加樣時避免氣泡，操作盡量快速以減少蒸發(fā)差異。
4. 藥物與MTT直接反應(yīng)
問題：具有氧化還原性的藥物(如維生素C、谷胱甘肽)會直接還原MTT生成棕褐色沉淀，導(dǎo)致假陽性結(jié)果。
解決方案：加藥前用PBS清洗細(xì)胞2~3次去除殘留藥物，或改用CCK8法避免干擾。
5. DMSO溶解不完
問題：甲瓚結(jié)晶未充分溶解會導(dǎo)致吸光度偏低且數(shù)據(jù)波動大。懸浮細(xì)胞離心后吸上清時可能誤吸結(jié)晶，貼壁細(xì)胞傾斜角度不足也會殘留結(jié)晶。
解決方案：貼壁細(xì)胞可傾斜30°緩慢吸液，懸浮細(xì)胞需離心后吸上清；DMSO溶解后37℃孵育10~20min并振蕩10min，確保結(jié)晶溶解。
6. 污染與操作失誤
問題：細(xì)菌或真菌污染會消耗營養(yǎng)并改變培養(yǎng)基pH，導(dǎo)致OD值異常升高；加MTT后立即變藍(lán)黑色提示污染。此外，移液器精度不足或復(fù)孔設(shè)置過少(<3個)也會增加誤差。
解決方案：實驗前鏡檢確認(rèn)無污染；使用校準(zhǔn)過的移液器，關(guān)鍵步驟重復(fù)3~5個復(fù)孔；調(diào)零孔與對照孔需嚴(yán)格設(shè)置以排除培養(yǎng)基和溶劑干擾。
總結(jié)
MTT檢測細(xì)胞增殖凋亡實驗的可靠性依賴于細(xì)節(jié)把控。若OD值異常，需從細(xì)胞狀態(tài)、試劑質(zhì)量、操作規(guī)范三方面排查。對于特殊藥物或敏感細(xì)胞系，建議結(jié)合ATP測定法、LDH法等交叉驗證，以提高結(jié)果準(zhǔn)確性。
