RIP技術(shù)主要是運(yùn)用針對(duì)目標(biāo)蛋白的抗體把相應(yīng)的RNA-蛋白復(fù)合物沉淀下來(lái)，經(jīng)過(guò)分離純化就可以對(duì)結(jié)合在復(fù)合物上的RNA進(jìn)行q-PCR驗(yàn)證或者測(cè)序分析。RIP是研究細(xì)胞內(nèi)RNA與蛋白結(jié)合情況的技術(shù)，是了解轉(zhuǎn)錄后調(diào)控網(wǎng)絡(luò)動(dòng)態(tài)過(guò)程的有力工具，可以幫助我們發(fā)現(xiàn)miRNA的調(diào)節(jié)靶點(diǎn)。根據(jù)需求，金開(kāi)瑞可以提供RNA/蛋白、RNA/RNA互作驗(yàn)證RIP技術(shù)服務(wù)。
應(yīng)用：
1.用抗體或表位標(biāo)記物捕獲細(xì)胞核內(nèi)或細(xì)胞質(zhì)中內(nèi)源性的RNA結(jié)合蛋白；
2.防止非特異性的RNA的結(jié)合；
3.免疫沉淀把RNA結(jié)合蛋白及其結(jié)合的RNA一起分離出來(lái)；
4.結(jié)合的RNA序列通過(guò)定量RT-PCR或高通量測(cè)序(RIP-Seq)方法來(lái)鑒定。
RIP實(shí)驗(yàn)流程：
(一)細(xì)胞裂解液獲取
A.單層細(xì)胞或者貼壁細(xì)胞處理
1.冷PBS清洗培養(yǎng)皿或培養(yǎng)瓶中的細(xì)胞兩次
2.加入冷PBS后用細(xì)胞刮將細(xì)胞刮下來(lái)，收集至enpendoff管
3.1500rpm，4℃離心5min，棄上清，收集細(xì)胞
4.用與細(xì)胞等體積的RIP裂解液重懸細(xì)胞，吹打均勻后于冰上靜置5min
5.每管分裝200ul細(xì)胞裂解液，貯存于-80℃
B.懸浮細(xì)胞處理：先收集細(xì)胞再計(jì)數(shù)，然后清洗裂解
C.組織樣品處理
1.冷PBS清洗新鮮切下的組織三次
2.加入冷PBS后，用勻漿器或其他細(xì)胞分離設(shè)備使組織分散為單個(gè)細(xì)胞，計(jì)數(shù)
3.1500rpm，4℃離心5min，棄上清，收集細(xì)胞
4.用與細(xì)胞等體積的RIP裂解液重懸細(xì)胞，吹打均勻后置于冰上靜置5min
5.每管分裝200ul細(xì)胞裂解液，貯存于-80℃
(二)磁珠的準(zhǔn)備
A.實(shí)驗(yàn)前準(zhǔn)備
1、enpendoff管
2、磁力架
3、冰盒，RIPWashBuffer置于冰上
4、抗體，置于冰上
5、渦旋震蕩器
6、槍、槍頭放于超凈臺(tái)照射30min，槍噴DEPC水
B.磁珠準(zhǔn)備過(guò)程
1.重懸磁珠
2.標(biāo)記實(shí)驗(yàn)所需的enpendoff管，樣品包括目的樣品，陰性對(duì)照與陽(yáng)性對(duì)照
3.吸取50ul重懸后的磁珠懸液于每個(gè)enpendoff管
4.每管加入500ulRIPWashBuffer，渦旋震蕩
5.將enpendoff管置于磁力架上，并左右轉(zhuǎn)動(dòng)15°使磁珠吸附成一條直線，去上清，重復(fù)一次
6.用100ul的RIPWashBuffer重懸磁珠，加入約5ug相應(yīng)抗體于每個(gè)樣品中
7.室溫孵育30min
8.將enpendoff管置于磁力架上，棄上清
9.加入500ulRIPWashBuffer，渦旋震蕩后棄上清，重復(fù)一次
10.加入500ulRIPWashBuffer，渦旋震蕩后置于冰上
