熒光定量PCR技術(shù)是指在PCR反應(yīng)體系中加入熒光基團(tuán)，通過(guò)熒光信號(hào)不斷累積而實(shí)現(xiàn)實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)PCR全程，然后通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)未知模板進(jìn)行定量分析的方法。
將熒光基團(tuán)加入到PCR反應(yīng)體系中，通過(guò)不斷累積熒光信號(hào)從而使對(duì)PCR全程的實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)實(shí)現(xiàn)，再根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線定量分析未知模板的方法，即是熒光定量PCR技術(shù)。在實(shí)時(shí)熒光定量PCR中，實(shí)時(shí)檢測(cè)全程PCR擴(kuò)增過(guò)程，按照反應(yīng)時(shí)間和熒光信號(hào)的變化能夠?qū)⒁粭l曲線繪制成。
熒光定量PCR注意事項(xiàng)：
1.操作規(guī)范
需要規(guī)范樣品核酸提取和實(shí)時(shí)熒光擴(kuò)增時(shí)的操作，避免樣品交叉污染，酶被降解，出現(xiàn)假陽(yáng)性的情況。
?。?）根據(jù)試驗(yàn)的分區(qū)嚴(yán)格操作，按照提取區(qū)、擴(kuò)增區(qū)、檢測(cè)區(qū)單方向流動(dòng)，不能夠逆向流動(dòng)物品、樣品和試劑。
?。?）在對(duì)多份樣品進(jìn)行操作的時(shí)候，制備反應(yīng)混合液，首先混合好熒光PCR反應(yīng)液、熒光探針和酶。之后在每個(gè)PCR管中進(jìn)行分裝，如此不僅會(huì)使操作次數(shù)減少，而且能夠使污染避免，還能夠使反應(yīng)的度增加。
?。?）在對(duì)樣品和蛋白酶k添加的過(guò)程中，要對(duì)避免酶的降解和樣品的交叉污染尤其留心。
?。?）在操作的時(shí)候，需要將陰性及陽(yáng)性對(duì)照設(shè)立，能夠?qū)晒釶CR反應(yīng)的準(zhǔn)確性和可信性進(jìn)行驗(yàn)證。
?。?）使用的離心管、槍頭和PCR管需要確保沒(méi)有污染，或者將它們進(jìn)行高壓滅菌。
?。?）在完成核酸的提取之后應(yīng)當(dāng)立刻進(jìn)行儀器的擴(kuò)增，不能夠在室溫環(huán)境下過(guò)長(zhǎng)時(shí)間放置提取的核酸，空氣中的酶能夠輕易的將其降解，其可以在－70℃冰箱內(nèi)長(zhǎng)期保存，在－20℃冰箱內(nèi)短期保存。
?。?）因?yàn)楫a(chǎn)物氣溶膠或標(biāo)本DNA會(huì)很容易對(duì)移液器造成污染，所以需要使用可高壓處理的移液器。
2.溫度設(shè)置
在對(duì)熒光PCR程序進(jìn)行設(shè)置的時(shí)候，應(yīng)當(dāng)需對(duì)程序中的目標(biāo)溫度、恒溫時(shí)間和循環(huán)次數(shù)等參數(shù)仔細(xì)的核對(duì)，PCR檢測(cè)結(jié)果會(huì)受到不正確的參數(shù)設(shè)置的影響。延伸過(guò)程中，需要對(duì)熒光信號(hào)的讀取收集進(jìn)行設(shè)置。如果不對(duì)收集熒光進(jìn)行設(shè)置，那么試驗(yàn)數(shù)據(jù)將無(wú)法保存，檢測(cè)結(jié)果將沒(méi)有辦法判定，從而導(dǎo)致試驗(yàn)失敗。
3.儀器擺放
放置實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀的臺(tái)面應(yīng)當(dāng)平穩(wěn)，離水池較遠(yuǎn)，少灰，干燥，不能有強(qiáng)光直射，室內(nèi)應(yīng)當(dāng)沒(méi)有腐蝕性氣體合良好的通風(fēng)。
