免疫熒光技術（Immunofluorescencetechnique）又稱熒光抗體技術，是標記免疫技術中發(fā)展zui早的一種。它是在免疫學、生物化學和顯微鏡技術的基礎上建立起來的一項技術。很早以來就有一些學者試圖將抗體分子與一些示蹤物質(zhì)結合，利用抗原抗體反應進行組織或細胞內(nèi)抗原物質(zhì)的定位。它是根據(jù)抗原抗體反應的原理，先將已知的抗原或抗體標記上熒光基團，再用這種熒光抗體（或抗原）作為探針檢查細胞或組織內(nèi)的相應抗原（或抗體）。利用熒光顯微鏡可以看見熒光所在的細胞或組織，從而確定抗原或抗體的性質(zhì)和定位。
免疫熒光實驗的主要步驟包括細胞片制備、固定及通透（或稱為透化）、封閉、抗體孵育及熒光檢測等。細胞片制備（通俗的說法是細胞爬片）是免疫熒光實驗的步，細胞片的質(zhì)量對實驗的成敗至關重要，原因很簡單，如果發(fā)生細胞掉片，一切都無從談起。這一步關鍵的是玻片（SlidesorCoverslips）的處理以及細胞的活力，有人根據(jù)成功經(jīng)驗總結出許多有益的細節(jié)或小竅門，非常值得借鑒。固定和通透步驟重要的是根據(jù)所研究抗原的性質(zhì)選擇適當?shù)墓潭ǚ椒?，合適的固定劑和固定程序?qū)τ讷@得好的實驗結果是非常重要的。免疫熒光中的封閉和抗體孵育與其它方法（如ELISA或WesternBlot）中的相同步驟是類似的，重要的區(qū)別在于免疫熒光實驗中要用到熒光抗體，因此必須謹記避光操作，此外抗體濃度的選擇可能更加關鍵。后需要注意的是，標記好熒光的細胞片應盡早觀察，或者用封片劑封片后在4℃或-20℃避光保存，以免因標記蛋白解離或熒光減弱而影響實驗結果。
基本實驗步驟：
?。?）細胞準備。對單層生長細胞，在傳代培養(yǎng)時，將細胞接種到預先放置有處理過的蓋玻片的培養(yǎng)皿中，待細胞接近長成單層后取出蓋玻片，PBS洗兩次；對懸浮生長細胞，取對數(shù)生長細胞，用PBS離心洗滌（1000rpm,5min）2次，用細胞離心甩片機制備細胞片或直接制備細胞涂片。
（2）固定。根據(jù)需要選擇適當?shù)墓潭▌┕潭毎?。固定完畢后的細胞可置于含疊氮納的PBS中4℃保存3個月。PBS洗滌3×5min。
?。?）通透。使用交聯(lián)劑（如多聚甲醛）固定后的細胞，一般需要在加入抗體孵育前，對細胞進行通透處理，以保證抗體能夠到達抗原部位。選擇通透劑應充分考慮抗原蛋白的性質(zhì)。通透的時間一般在5-15min，通透后用PBS洗滌3×5min。
?。?）封閉。使用封閉液對細胞進行封閉，時間一般為30min。
（5）一抗結合。室溫孵育1h或者4℃過夜。PBST漂洗3次，每次沖洗5min。
（6）二抗結合。間接免疫熒光需要使用二抗。室溫避光孵育1h，PBST漂洗3次，每次沖洗5min后，再用蒸餾水漂洗一次。
?。?）封片及檢測。滴加封片劑一滴，封片，熒光顯微鏡檢查。
